بررسی توالیی ن M2 بهمنظار تعاان مقیومت به آ لمینتی نویسندگان: حوریه صادری فریدا بهزادیان الهام مؤثر پرویز اولیاء

Transcription

1 بررسی توالیی ن ویورو هوی آنفواننال دانشور پزشكي دوماهنامه علمي-پژوهشي دانشگاه شاهد سال بیستوچهارم-شماره 031 شهریور 0331 دریافت: 6031/30/30 آخزین اصالحها: 6031/30/62 پذیزش: 6031/30/40 جدلشوودا لب باروویرل لیرلنووی ر سووی بهمنظار تعاان مقیومت به آ لمینتی هی 4 3 *2 1 نویسندگان: حوریه صادری فریدا بهزادیان الهام مؤثر پرویز اولیاء هرکس تحق قبت ه کرةؼ بظ ه لک ل دا ؽگب ؼب ذ ت راى ا راى. 2. پص ؽکذ عل م ف بر ز عت دا ؽگب هبلک اؼتر ت راى ا راى. 3. پص ؽکذ عل م ف بر ز عت دا ؽگب هبلک اؼتر ت راى ا راى. 4. هرکس تحق قبت ه کرةؼ بظ ه لک ل دا ؽگب ؼب ذ ت راى ا راى * ع ذ هعئ ل: فر ذا ث ساد بى چکادا مقدمه و هدف: آداماوتان ا )آماوتاد ه ي ر ماوتااد ه ااا fbehzadian@yahoo.com اا تایا ش طای ی ي درماان ت وا تاا ي یيس آو الوزا اات اد ضذ اا. ا ه داري اا مماوتا نىىاذ اا شایيین ه ا اه ي ایيس م تاضىذ ي تیخ از جاوط ى ا اا ذ آم ى در قسم ت ه غطائ ا ه شیيین ه اثة مقايم تا ا اه داري ا م ض د. ا ه مطالت تامىظا ر تیراا یی ایاو یا ال و نین ی اذ ماییثق تاا مقايما تا آداماوتان ادر ژن اابیا پ ا ي جذاضذ از ت مااران ا یاوا در ااا 3131 صا رو گیف. مال و روشهی: ا اب ا ت ى گیفتضذ در ی یان ط زمساتان ااا 3131 از ت مااران دارا تئئا ضث آو الوزا تا ريش Real-Time Reverse Transcription PCR م ردتیرا قیار گیفتىذ یاا ضوا ر اابیا پ ا ي ي یيس آو الوزا ی پ در آن ا یت ه گیدد. اپس تیخ از وم و اا مثث از وظی ا ه ي یيس ا در نط اای ل یثث ای داد ضاذوذ. تایا یثث ای ژن تاا ريش Reverse Transcriptionي PCR آوال ز ژوت ث چ ار جذا از ی اابیا پ تط ر یصادف اوتخاب گید ذوذ. نتییج: مطالت ج ص ا وقطا در ی ال ژن جذا ا م ردتیرا وطاند ىذ ضو ر ضا عیی ه ج ص مىجیض وذ ت مقايم ت آداماوتان ا تى جا یز ى اا ذ آم ى آااپاراژ ه تاجاا اای ه در م قت 13 در م آن ا ت د. اا ی ج ص ا ا جادنىىذ مقايم ت آداماوتان ا اف وطذ. نتاجهگار : تا ی ج ت وتا ج ا ه مطالت ي گزارش ا ااا ی مقققاان نا وطااند ىاذ ضا تااال ج ص افت ا مقايم ت آداماوتان در جذا ا اوساو ي یيس آو الوزا اا ش طى اد م ض د ن آداماوتان ا تیا درمان آو الوزا اات اد وط وذ. ولنگی کلاد : ي یيس آو الوزا شیيین ه آداماوتان ج ص 13

2 تیرا ی ال ژن ي یيس ا آو الوزا جذاضذ از ت ماران ا یاو در اا مقدمه رض ب آ ف ال سا ث ع اى عبهل اصل پرتئ ي ت ظط ک از ش ه قطع ؽت 1 ث وبر ب ت فع حبد در د ب ؼ بخت ؼذ ا ذ. ظبزهبى رض کذ ه ؼ ذ )5(. ث ذاؼت خ ب گسارغ کرد اظت ک حذد ک ه ل برد ه رد عف ت فصل در ر ظبل رخ ه د ذ ک 3 تب 5 ه ل ى ث وبر حبد 300 تب 500 سار هرگ را ظجت ه گردد. اهرز در خوع ت ب ا عب د ظبةتب پ رض ع در گردغ ه ثبؼ ذ )1(. ث ه ظ ر کب ػ در ث وبر ترؼح رض ه ساى ثعتر ؼذى هرگ در افراد عف ت بفت ثب رض از دار ب ضذ رظ اظتفبد ه ؼ د )2(. ا ي دار ب ثرا پ ؽگ ر از عف ت ثب ا ي رض ب س هصرف ه ؼذ ذ ل ثب ا دبد اکعي ب هؤثر از ا ي اهر کبظت ؼذ اظت )3(. آداهب تبى ب ع آهب تبد ي ر وب تبد ي دار ب عت ذ ک ظبل بظت ثرا پ ؽگ ر درهبى عف ت ثب رض اظتفبد ه ؼ ذ. ا ي دار ب هوب عتک ذ ب پرتئ ي ا ي رض ه ثبؼ ذ )2 4(. د پرتئ ي 1 )پرتئ ي هبتر کط( پرتئ ي )کب بل در پ ؼػ رض( ت ظط قطع فتن ش م رض کذ ه ؼ ذ. پرتئ ي قػ اظبظ در اا ل چرخ تکث ر رض دارد. ثعذ از ا ذظ ت ز رض قرارگرفتي آى در ا ذزم ا ي پرتئ ي در ت د اظ ذ ؼذى ا ذزم فعبلؼذ ظجت رد پرت ى ب ث داخل ر ى ه گردد ک ه در ث خذاؼذى ه ب ک ػ الکترظتبت ک ث ي کوپلکط ر ج کلئ پرتئ ي پرتئ ي هبتر کط آزادؼذى ر ج کلئ پرتئ ي ث داخل ظ ت زل ظل ل آل د ه ؼ د. از ظر ظبختوب پرتئ ي قعوت ب N رض دارا 97 اظ ذ آه ث د دارا تره بل خبرج ظل ل )اظ ذ ب آه 1 تب 23( ث ي غؽبئ )اظ ذ ب آه 24 تب 46( تره بل C داخل ظل ل )اظ ذ ب آه 47 تب 97( اظت. د هتأظفب هقبهت ث آداهب تبى ب در ظ ب رض خذاؼذ در ه بطق هختلف خ بى گسارغ ؼذ ر ث افسا ػ اظت در ظ ب هقبم خب ؽ ب اظ ذ آه در قعوت ث ي غؽبئ پرتئ ي در اظ ذ آه ب ب د ذ ؼذ اظت )1 3-12(. ثب خ د ا و ت ظ ب هقبم ث آداهب تبى ب گسارغ ب کو در ا ي زه از ا راى ه تؽر ؼذ اظت )15-13(. ث بثرا ي هطبلع حبضر ث ه ظ ر ثررظ حض ر خ ػ ب هقبهت ث آداهب تبى در ر د ظبةتب پ خذاؼذ از ث وبراى در ت راى ص رت گرفت. رض مال و روشهی جدلسیب و شنیسییی ویرو در ک هطبلع هقطع در زهعتبى 1393 و ظ اة ث ث وبراى دارا عالئن ثبل آ ف ال سا ثب رغPCR Real Time Reverse Transcription قرار گرفت تب حض ر رض آ ف ال سا ت پ ا ي ه ظ ر از ک ت ه ردثررظ در آى ب هؽخص ؼ د. ثرا SuperScript III Platinum One- Step qrt-pcr ظبخت ؼرکت Invitrogen آهر کب ثراظبض رغ ت ص ؼذ ت ظط ظبزهبى ث ذاؼت خ ب اظتفبد ؼذ )16(. ظپط ثرخ از و ب هثجت از ظر ا ي رض ب ث کؽت ظل ل تلق ح DCK گرد ذ. رض ب خذاؼذ تب زهبى آزهب ػ ب ثعذ گ ذار ؼذ ذ. تکث ر شى : چ بر خذا از ر ظبةتب پ ث ط ر تصبدف ثرا تکث ر شى ثب رغ Reverse transcriptase )RT-PCR(PCR آ بل س ش ت ک ا تخبة گرد ذ ذ. اثتذا ا ي خذا ب د ثبر در ظل ل DCK تکث ر داد ؼذ ذ. ظپط ثب اظتفبد از ک ت اظتخراج اظ ذ کلئ ک رظ ظبخت ؼرکت کتب تد س آزهب ا راى RN

3 ض ر صادر ي مثاران رظ از 300 ه کرل تر از هب ع ر کؽت ر ک DCK رض را خذا وب ن. چ بر خذا از ر از ا ي خذا ب در 20 ه کرل تر آةهقطر ث دظت آهذ. ظ ةتب ب پ ث ط ر تصبدف ا تخبة ؼذ ذ ثعذ از د ثبر پرا ور ب اختصبص ثرا تکث ر قطع ظبةتب پ ثب اظتفبد از رمافسار ش م ر د )version 7.2.5( BioEdit طراح گرد ذ ک ت ال ا ذاز قطع تکث رداد ؼذ در خذل 1 ؽبى داد ؼذ اظت. تکث ر شى خذا ب ثب اظتفبد از ک ت one-step RT-PCR ظبخت ؼرکت کتب تد س آزهب ا راى پرا ور ب طراح ؼذ ثب ثر به ز ر ص رت گرفت: عخ ثردار هعک ض در 50 C 30 دق ق 40 چرخ ؼبهل ظ هرحل C 95 C 58 ثب ث هذت 40 ثب 72 C در ب ت هرحل ط لؼذى ا ت ب در ث هذت ث هذت 20 ث هذت 1 دق ق 72 C ث هذت 10 دق ق. قطع ب تکث رداد ؼذ ر شل آگبرز 1/5 درصذ ؼ بظب ؼذ ذ. تع ي ت ال هطبلع آى: قطع ب تکث رداد ؼذ ثب اظتفبد از ک ت GF-1 PCR Clean-up ؼرکت Vivantis هبلس از شل اظتخراج گرد ذ. پرا ور ب ه رداظتفبد ثرا تع ي ت ال هؽبث پرا ور ب ه رداظتفبد ثرا تکث ر قطع اظتفبد از ک ت ث د. تع ي ت ال در ر د خ ت ثب BigDye Terminator v3.1 Cycle BI PRIS 3700 DN nalyzer Sequencing Sequencer ظبخت ؼرکت pplied Biosystems اهر کب ت ظط آزهب ؽگب تع ي ت الLaboratories First BSE در تکث ر در ظل ل DCK تکث ر شى ثب رغ Reverse Transcription PCR الکترف رز قطعبت حبصل ص رت گرفت ک ؼکل 1 و ا از آى را ؽبى ه د ذ. ت ال ب شى NCBI از از خذا ب ه ردهطبلع در پب گب ش ثجت گرد ذ ک عذد دظترظ آى ب ثرا ظ ب تب KT ثرا ظ ب KT تب KT ث د. KT ؼجب ت ت ال کلئ ت ذ شى رض ب ه ردهطبلع ک در ظبل 1393 خذا ؼذ ث د ذ ثب ظ اکعي وبى ظبل ث ترت ت 98/47-99/08 درصذ 98/77-99/28 درصذ ث د. ؼجب ت ت ال اظ ذ آه ا پ ػث ؼذ ثر اظبض ت ال کلئ ت ذ ثرا پرتئ ي ب رض ب 1 ه ردهطبلع ث ترت ت 98/81 درصذ 99/9 درصذ ثرا پرتئ ي ب ث ترت ت 96/9-98/96 درصذ 98/96-99/9 درصذ ث دظت آهذ. و ؽت خذا ه ردثررظ رض ب دارا ؼب عتر ي خ ػ هقبهت ث آداهب تبى ث د ذ ک ا ي خ ػ ظجت خب ؽ اظ ذ آه آظپبراش ي ث خب ظر ي در اظ ذ آه 31 هبلس ا دبم ؼذ. و ت ال ب در ثب ک اطالعبت پرتئ ي ه ؼ د. ظب ر خ ػ ب گسارغؼذ در ثجت ؼذ ذ. نرد فظبز ثب اظتفبد از هطبلعبت خبرخ در قعوت ث ي غؽبئ پرتئ ي ب GenBank رمافسار BioEdit )7.2.5 )version در هقب ع ثب ظ در اظ ذ آه ب ب ک ه در اکعي وبى ظبل تع ي گرد ذ. ث هقبهت ث ا ي دار ب ه ؼ د در خذا ب نتییج از ثرخ از و ب ظ اة ث ک در آزهب ػ Real Time Reverse Transcription PCR از ظر رض آ ف ال سا ت پ ه ردهطبلع هؽب ذ گرد ذ. اظ ذ آه ب ه خ د در ا ي هحل ب در ا ي خذا ب هؽبث ظ اکعي ث ترت ت ل ظ ي ال ي آال ي گال ع ي ل ظ ي تر پت فبى آظپبرت ک اظ ذ ث د ذ. هثجت ؼذ ث د ذ ت ا عت ن ثعذ از تلق ح ث کؽت ظل ل

4 تیرا ی ال ژن ي یيس ا آو الوزا جذاضذ از ت ماران ا یاو در اا جدو 3. تالیی پرلیررهی طرلحیشدا برل تکثار قطعه ننام هر سیبتییپ ویرو آنفاننال و لندلبۀ قطعۀ سابتایپ ویروس تکثار ل اشدا توالي پرایمر ( 3 5) Forward Reverse Forward Reverse GTGGTCTTCTCCGGG TTTCTCTGCTCTTGTTGC TTTGGTGGCCTTCT TTTCTCCCTCTTGCTGC اندازۀ قطعه (bp) شکل 3. تصایر ن لیکتروفارب یک سایه جدلشدا لب باریرل ر لین مطییعه )چیهک 1(. کنتر و میرکر وب نر بینی 311 جفت بیب بهترتاب ر چیهکهی بحث رض ب هقبم ث آداهب تبى ب از هی 3 و 2 و 4 قرلر ل ا شدالند. مثبت ا تقبل ز بد دار ذ ث وبر زا ه ثبؼ ذ )8(. و ي اهر ظبةتب پ از ظبل 2003 در ظرتبظر د ب در حبل ه در ث هطبلع خ ت بفتي دار بئ ؼذ اظت ک ثر گردغ ه ثبؼ ذ ل ال ي افسا ػ در ثرز هراحل د گر چرخ تکث ر رض آ ف ال سا هؤثر ثبؼ ذ رض ب هقبم ث ظبةتب پ ک از آى خول ه ت اى ث اظلتبه ر زا به ر ک 2007 آداهب تبى در ظبل ب 2006 ه الد گسارغ تب هوب عتک ذ رآه ذاز رض آ ف ال سا عت ذ اؼبر 7(. ؽبى داد ؼذ اظت ک هقبهت ث و د )1 4(. گرد ذ )6 آداهب تبى ب آظبىتر از هقبهت ث ظب ر هوب عتک ذ ب در خذا ب هقبم ث آداهب تبى در کؽ ر ب تکث ر ا دبد ه ؼ ذ ظ ب هقبم فقط در ط هختلف خ ػ ب قط ا ه فرد در کلئ ت ذ ب شى درهبى ضذ رظ ا دبد ه ؼ ذ ثلک در عذمحض ر د ذ ؼذ ک ظجت خب ؽ اظ ذ آه ب ا ي فؽبر دار س ا دبد ه تؽر ه گرد ذ. ا ي 30 ب ه ؼ ذ فرااىتر ي آى در رض ب هقبم از ظر ش ت ک پب ذار ث د قبثل ت اظ ذ آه 31 اظت ک ظجت خب ؽ آظپبراش ي ث خب

5 ض ر صادر ي مثاران ظر ي )S31N( ه گردد )10 17(. هطبلعبت عجتب ز بد ث ذاؼت دا ؽگب ت راى هرکس هل آ ف ال سا و در زه رض ب هقبم ث آداهب تبى ب ظ ب رض در کؽ ر ب هختلف د ب ص رت گرفت اظت از خول / در و خذا ب رض آ ف ال سا فصل خذاؼذ از ا عبى در ظبل ب 2008 تب 2009 ه الد در کؽ ر اگب ذا خ ػ S31N هطبلع ا دبمگرفت در ظبل د ذ ؼذ اظت )18(. در 2009 ه الد در شاپي س ث ػ از 5000 ت ال رظ ه ردثررظ قرار گرفت S31N S31N ک ؽبى داد و کالظتر ب هقبم دارا خ ػ ث د ذ ع فقط شى ب دارا ه تبظ ى ثبق هب ذ ظ ب دارا ا ي خ ػ ه ت ا ذ ث ؼکل هؤثر آى را ث عل ثعذ ا تقبل د ذ )19(. در ک هطبلع د گر خذا ب از 34 ث وبر در ظبل ب 2004 تب 2008 ه الد در بى ه ساى خ ػ S31N از صفر درصذ ث 25 درصذ رظ ذ ک ث اظتفبد گعترد از دار ب آداهب تبى عجت داد ؼذ )20(. هطبلعبت هحذد در زه هقبهت ث آداهب تبى ب در رض ب ا راى در ظب ت ب هعتجر ا تر ت ه تؽر ؼذ اظت. در ثررظ ص رتگرفت در دا ؽکذ خذاؼذ در ط ظبل ب 2005 تب 2008 ه الد دارا خ ػ S31N هطبلع ث د ذ )15-13(. از هحذد ت ب ا ي تعذاد کن خذا ب ه ردثررظ ث علت س ثبال رغ ب ه رداظتفبد از خول تع ي ت ال ث د اهب در ر د ظبةتب پ رض ب خذاؼذ از ث وبراى ا را در ظبل 1393 هقبهت ث دار ب آداهب تبى )آهب تبد ي ر وب تبد ي( را ؽبى داد ک هؽبث تب ح ث دظتآهذ در ظب ر هطبلعبت داخل خبرج کؽ ر اظت. ث ظر ه رظذ ثب ت خ ث فراا هقبهت ث آداهب تبى ب در رض ب ث درهبى اظتفبد ؼ د. تشکر و قدر لنی ثذ ي ث تر اظت از دار ب د گر در ه ارد بز ظ ل از کل افراد ک در ت و ب ه ردثررظ هب را بر و د ذ قذردا ه ؼ د. ا ي هطبلع ثب حوب ت هبل هرکس تحق قبت ه کرةؼ بظ ه لک ل دا ؽگب ؼب ذ ا دبم گرفت اظت. منیبع 1. Li TC, Chan C, Lee N. Clinical implication of antiviral resistance in influenza. Viruses 2015; 7(9): Treanor JJ. Influenza Viruses. In: R Kaslow, LR Stanberry, JW Le Duc. editors. Viral Infections of Humans- epidemiology and control. New York: Springer Science + Business edia; 2014; Saito R, Li D, Shimomura C, asaki H, Le Q, Nguyen HL, et al. n off-seasonal amantadineresistant influenza outbreak in Japan. Tohoku Journal of Experimental edicine 2006; 210(1): Król E, Rychłowska, Szewczyk B. ntiviralscurrent trends in fighting influenza. cta biochimica Polonica 2014; 61(3): Pielak R, Chou JJ. Influenza proton channels. Biochimica et Biophysica cta 2011; 1808(2): bed Y, Goyette N, Boivin G. Generation and characterization of recombinant influenza () viruses harboring amantadine resistance mutations. ntimicrobial gents and Chemotherapy 2005; 49(2): Nelson I, Simonsen L, Viboud C, iller, Holmes EC. The origin and global emergence of adamantine resistant () influenza viruses. Virology 2009; 388(2): Hayden FG, de Jong D. Emerging influenza antiviral resistance threats. Journal of Infectious Diseases 2011; 203(1): Deyde V, Xu X, Bright R, Shaw, Smith CB, Zang Y, et al. Surveillance of resistance to adamantanes among influenza () and () viruses isolated worldwide. Journal of Infectious Diseases 2007; 196(2): Bright R, edina J, Xu X, Perez-Oronoz G, Wallis TR, Davis X, et al. Incidence of adamantane resistance among influenza () viruses isolated worldwide from 1994 to 2005: a cause for concern. Lancet 2005; 366 (9492): Dong G, Peng C, Luo J, Wang C, Han L, Wu B, et al. damantane-resistant influenza viruses in the world ( ): frequency and distribution of gene mutations. PLoS One 2015; 10(3): e Hurt C. The epidemiology and spread of drug resistant human influenza viruses. Current Opinion in Virology 2014; 8: 22-9.

6 تیرا ی ال ژن ي یيس ا آو الوزا جذاضذ از ت ماران ا یاو در اا Yavarian J, zad T, Zheng X, Gregory V, Lin YP, Hay. mantadine resistance in relation to the evolution of influenza () viruses in Iran. ntiviral Research 2010; 88(2): Yavarian J, okhtari zad T, Shafiei Jandaghi NZ, Nategh R. mantadine-resistant influenza () viruses in Iran. cta Virologica 2009; 53(2): Yavarian J, Shafiei Jandaghi NZ, Naseri, okhtari zad T. Characterization of variations in PB2, NS1,, neuraminidase and hemagglutinin of influenza () viruses in Iran. Jundishapur Journal of icrobiology 2014; 7(3): e World Health Organization. CDC protocol of realtime RTPCR for influenza () vailable from neflu/cdcrealtimertpcr_swineh1ssay- 2009_ pdf. 17. Schnell JR, Chou JJ. Structure and mechanism of the proton channel of influenza virus. Nature 2008; 451: Byarugaba DK, Ducatez F, Erima B, worozi E, illard, Kibuuka H, et al. olecular epidemiology of influenza / viruses circulating in Uganda. PloS one 2011; 6(11): e Furuse Y, Suzuki, Kamigaki T, Oshitani H. Evolution of the gene of the influenza virus in different host species: large-scale sequence analysis. Virology Journal 2009; 6: elidou, Kyriazopoulou V, Diza E, lexiou S, Pierroutsakos Y. ntiviral resistance of influenza () strains isolated in northern Greece between 2004 and Euro Surveillance 2009; 14(4)

7 Daneshvar(medicine) shahed University/ 24 th year/2017 /NO.130 Daneshvar edicine Scientific-Research Journal of Shahed University 24th Year, No.130 ugust- September 2017 Survey of gene sequence of influenza viruses isolated from Iranian patients in 2014 for determination of adamantane resistance Horieh Saderi 1, Farida Behzadian 2,*, Elham oasser 2, Parviz Owlia 1 1. olecular icrobiology Research Center, Shahed University, Tehran, Iran 2. Research Centre for Biosciences and Biotechnology, alek-shtar University, Tehran, Iran * Corresponding author fbehzadian@yahoo.com bstract Background and Objective: damantanes, amantadine, and rimantadine have been used for many years for prevention and treatment of influenza virus infections. These drugs are influenza virus protein inhibitors and some amino acids substitutions in transmembrane portion of this protein cause resistance to them. This study was done for survey of adamantane resistance related nucleotide sequence changes in gene of and subtypes isolated from Iranian patients in ateriasl and ethods: Nasal swabs of patients with influenza-like symptoms were collected from Tehran through winter 2014 and were examined by Real Time Reverse Transcription PCR to evaluate presence of subtypes of and of influenza viruses in them. Then, some positive samples for these viruses were propagated in cell culture. Four isolates from each subtype were randomly selected for gene amplification by Reverse Transcription PCR and genetic analysis. Results: The study of point mutations in gene sequence of isolates showed presence of most prevalent adamantane resistance related mutation; substitutions of serine with asparagine in amino acid 31; in all of them. Other mutations conferring resistance to adamantanes were not found. Conclusion: ccording to results of this study and reports from other investigators, which showed the high prevalence of adamantane resistant mutants in human influenza virus isolates, it is recommended that adamantanes not be used for the treatment of influenza. Keywords: Influenza virus, protein, damantanes, utation Received: 24/06/2017 Last revised: 08/08/2017 ccepted: 18/08/2017